GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS:
TRABAJO PRÁCTICO N° 1: Determinación de compartimientos líquidos del organismo: volumen plasmático, volumen extracelular, volumen intersticial y volemia.
Introducción:
El agua corporal comprende los compartimientos extra e intracelular. El líquido extracelular está constituido por el plasma, el líquido del compartimiento intersticial y los líquidos transcelulares.
La distribución del agua en los distintos compartimientos ha sido fundamentalmente calculada por técnicas de dilución. Dichas técnicas se efectúan mediante la inyección de sustancias que se suponen están distribuidas uniformemente en el compartimiento cuyo volumen se desea calcular. Una vez alcanzado el equilibrio en su espacio de distribución, conociendo la cantidad total inyectada y determinando la concentración de la sustancia en dicho espacio, podremos calcular el volumen aparente de distribución. Los compartimientos líquidos del organismo pueden variar debido a influjo o eflujo de agua o solución.
La sustancia marcadora utilizada debe reunir ciertos requisitos:
a) no ser tóxica.
b) distribuirse homogéneamente dentro del compartimiento a medir.
c) no ser metabolizado durante el período de prueba.
d) no alterar el volumen del compartimiento en estudio.
Objetivo:
En la rata se evaluará:
- el volumen de distribución del colorante Azul de Evans (como estimación del volumen plasmático, VP).
- el volumen de distribución de SCN- (como estimación del volumen extracelular, VEC).
- el volumen intersticial (por diferencia: VEC – VP).
- la volemia (utilizando el dato del hematocrito).
Materiales:
Animales
-Ratas Wistar.
Quirúrgicos:
-Material de disección.
-Lámparas de calentamiento.
-Jeringas 10 ml (vidrio para punción cardíaca), 5 ml, 1ml.
-Gasa.
Generales:
-Capilares para hematocrito.
-Micropipetas automáticas.
-Tubos de centrífuga, Eppendorf, capilares, tubos de hemólisis.
-Balanzas analíticas y para animales.
-Cronómetros.
-Espectrofotómetro.
Reactivos:
Anestésico. Ketamina 50mg/ml, Xilasina 2%.
Tiocianato (SCN-): Colorante a inyectar: 2 g% en solución fisiológica.
Solución testigo: 10 mg %.
Acido tricloroacético (TCA) 10%.
Nitrato férrico 10 %.
Azul de Evans: Colorante a inyectar: 1 g/L en solución fisiológica.
Solución testigo: 250 mg/l.
Heparina (anticoagulante).
Solución fisiológica (Cloruro de sodio: 0,9 g/l)
Protocolo Experimental:
Las ratas previamente pesadas, se anestesian (dosis Ketamina 100mg/kg p.c, Xilasina 3mg/kg p.c) y a través de un pequeño corte en el extremo de la cola se recolecta sangre directamente en el capilar para la posterior medición del hematocrito (Hto). Luego, se efectúa una incisión a nivel inguinal a fin de localizar la vena femoral y se cateteriza con un catéter P40. Se inyectan 0,1 ml de la solución de Azul de Evans 1 g/L más 0,1 ml de la solución de tiocianato 2 g %. Exactamente 10 min después de la inyección se extrae sangre por punción cardíaca con aguja y jeringa heparinizadas. La sangre se centrifuga a 3000 rpm por 10 min. El sobrenadante (plasma) se divide en alícuotas de 200 µl en tubos Eppendorf. Las muestras de plasma se guardan a -20°C para las posteriores mediciones de Azul de Evans y de SCN-.
Para la medición del Hto se centrifugan los capilares cargados con sangre de la cola a 3000 rpm por 10 min.
Determinación de SCN- en plasma: Se toman 40 µl de plasma o 10 ul de Testigo (10 mg %) agregándole 1 ml de TCA 10% en tubo eppendorf, mezclar y dejar en reposo 5 min. Centrifugar 5 min a 10000 rpm. Tomar 700 µl del sobrenadante y agregarle 300 µl de nitrato férrico. Leer absorbancia a 500 nm.
Cálculo del volumen de distribución del SCN- (estimación del VEC):
Vd= Cantidad SCN- inyectado/ Concentración de SCN- plasmático
(esto es, VEC = Q/[SCN-]p),
donde: [SCN-]p= (Abs muestra x [testigo])/(Abs testigo x 4).
Determinación de Azul de Evans en plama: Se toman 200 µl de plasma y se llevan a 1 ml con agua destilada en tubos eppendorf. De la solución testigo se toman 20 µl y se lleva a 1 ml con agua destilada. La absorbancia de la muestra y el testigo, se lee a 620 nm contra blanco de agua destilada, con estos datos se calcula el volumen plasmático.
Cálculo del volumen de distribución de Azul de Evans (estimación del VP):
Volumen plasmático= Cantidad de Azul de Evans inyectado/ Concentración de Azul de Evans plasmático (esto es, VP = Q/[AE]p).
[AE]p= (Abs muestra x [testigo])/(Abs testigo x 10)
El volumen intersticial se calcula: VI= VEC-VP.
Para el cálculo de la VOLEMIA:
La volemia se calcula aplicando la fórmula:
Volemia = Vp/1-Hto (donde el Hto: está expresado en número decimal).
El resultado final se expresa cada 100 g de peso corporal.
Discusión de los resultados obtenidos.
Redacción de informe final: Título del trabajo, autores, introducción, objetivos, metodología, resultados y discusión.
Fecha límite de entrega de informe: a confirmar por el docente.
Bibliografía:
1-Apunte de Líquidos Corporales.
2-Berne-Levy, 6ta. edición.
TRABAJO PRÁCTICO N° 2: Transporte hepático de aniones orgánicos (Bromosulfoftaleína, BSF)
Introducción:
La transferencia de sustancias desde el plasma a la bilis se cumple en tres etapas:
1. captación hepática
2. transporte intracelular (y metabolismo)
3. excreción biliar
Entre dichas sustancias se encuentran las que tienen la característica de ser concentradas en la bilis para su excreción, como la bilirrubina, las sales biliares, los opacificadores biliares, los antibióticos como la rifampicina, los colorantes como la bromosulfoftaleina (BSF) y el verde de indocianina, etc. Algunas de estas sustancias sufren modificaciones en su paso por el hígado (metabolización, conjugación, etc.) y otras son eliminadas sin sufrir cambios. Como en general, la excreción biliar es mediada por proteínas, existe competición entre las sustancias mencionadas. Una de las sustancias más utilizadas en la exploración funcional hepática es la BSF. Este colorante es depurado del plasma por el hígado, conjugado parcialmente en los hepatocitos con glutation y excretado por una proteína transportadora hacia la bilis a concentraciones elevadas.
Objetivo:
Se evaluará la excreción biliar del colorante BSF en la rata.
Materiales:
Animales:
-Ratas Wistar.
Quirúrgicos:
-Jeringas de 1 y 2 ml.
-Agujas.
-Hilo de cirugía.
-Guantes descartables.
-Algodón y gasas.
-Tablas de cirugía, lámparas de calentamiento y termómetros.
-Tijeras, pinzas, sonda acanalada, catéteres P10 y P40.
-Tubos eppendorf para recolección de bilis.
Reactivos:
-Ketamina 50mg/ml, Xilasina 2%.
-Solución Fisiológica (SF, NaCl 0,9%).
-BSF (50 mg/ml, testigo 10 mg/ml en H2Od).
Generales:
-Balanzas analíticas y para animales.
-Cronómetros.
-Espectrofotómetro.
-Micropipetas automáticas.
Protocolo Experimental:
Se registra el peso de cada rata. En función del peso se calcula la cantidad de anestesia a administrar (dosis Ketamina 100mg/kg p.c, Xilasina 3mg/kg p.c). Se anestesia el animal y se coloca en la tabla de cirugía manteniendo su temperatura corporal con lámpara de calentamiento (36,5-37,5°, monitoreado con termómetro a través de la temperatura rectal). Se abre la pared abdominal y se localiza el colédoco, colocando una sonda acanalada por debajo del mismo. Se liga el colédoco en su parte inferior. Por encima de la ligadura y utilizando la sonda acanalada como superficie de apoyo, se efectúa una punción con aguja y, a través del orificio de esta, se introduce un Catéter (P10) de polietileno con el extremo biselado. Una vez introducido el catéter, se fija por intermedio de dos ligaduras, que engloban el catéter y la pared del colédoco. Se coloca un tubo Eppendorf de descarte para recolectar la bilis que sale del catéter.
Se realiza una segunda incisión a nivel de la región inguinal y se localiza la vena femoral, pasando la sonda acanalada por debajo, a la vez que dos hebras de hilo, que se dejan sin anudar. Se efectúa una punción con aguja y, a través del orificio generado, se introduce un catéter (P40).
Se controla que la temperatura de la rata esté alrededor de 37ºC y se comienza a recolectar bilis durante 10 min en tubo Eppendorf pre-pesado (bilis basal). Luego se inyectan 3 mg de BSF por 100 gr de peso corporal (solución stock de BSF 50 mg/ml). Luego, se procede a la recolección de bilis en tubos Eppendorf pre-pesados que serán cambiados cada 5 minutos durante 30 min.
Se guardan las muestras de bilis a -20ºC para la posterior determinación de BSF.
Determinación de BSF en bilis:
De cada muestra de bilis tomar 2 μl, agregarle 6 ml de Na(OH) 0,1N y leer a 580 nm contra blanco de agua destilada (solución testigo de BSF 10 mg/ml). Calcular la cantidad de BSF excretada en cada muestra. Representar gráficamente la velocidad de excreción de BSF (mg/min) en función del tiempo de recolección. Calcular la excreción biliar total de dicho anión, expresada como porcentaje de la cantidad inyectada.
Determinación de flujo biliar:
Se recogen las muestras de bilis en los tubos Eppendorf pre-pesados, calculándose el volumen de bilis por gravimetría (diferencia entre peso del Eppendorf antes y después de la recolección), asumiendo una densidad de la bilis de 1 mg/ml. Representar gráficamente el flujo biliar (ml/min) en función del tiempo.
Discusión de los resultados obtenidos.
Redacción de informe final: Título del trabajo, autores, introducción, objetivos, metodología, resultados y discusión.
Fecha límite de entrega de informe: a confirmar por el docente.
Bibliografía:
1-Meyer. “Fisiología Humana” Capítulo III pág: 134-140. Editorial Salvat, 1985.
